解析韩春雨新版实验方法

　　然而，随着时间推移，研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。8月2日，《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。8月8日，韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法，其中补充了数项应特别注意的问题。

　　(新版实验方法全文，可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下载)。

　　新版实验方法具体分为细胞培养、质粒/gDNA 共转染，以及基因组提取三个部分。对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods(详见 http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information)，新实验步骤有几处改变：

　　1 血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。

　　2 增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，换液时要小心操作”的小提示。

　　3 建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或24小时后，补转一次 gDNA;旧版方法中只提及了“24小时”。

　　4 旧版方法中，溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE(5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)，而新方法中则变更为水(pH 8.0)。

　　最后一处缓冲液配方的改变尤其引人注意——在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中，EDTA 再次出现：其中一条注意事项专门提到，应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入 EDTA。这四条注意事项分别是：

　　1 NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感，在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。

　　2 由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子，在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。

　　3 转染试剂 Lipofectamine®3000会阻碍 gDNA 进入细胞，不能用于转染。可以使用转染试剂 Lipofectamine® 2000。其他转染试剂是否可用还有待验证。

　　4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5’端磷酸化处理，处理体系如下：(体系略)处理后的 gDNA 无需再次纯化，直接用水(pH 8.0)稀释至300 μl，终浓度10 nM。

　　据 Nature 报道，韩春雨近来每天都会收到很多骚扰电话和短信，但他始终坚信自己的研究成果没有问题。Nature 将喜爱茶叶、古琴，并且从未出国的韩春雨称为“隐士”，而今这位隐士不得不走上风口浪尖，直面质疑。 据新华网消息，河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，并邀第三方证实。

　　为什么 NgAgo 会“不好使”?

　　NgAgo 之所以引起广泛关注，在于其作为基因编辑工具显现出的一些令人激动的新特性，赋予了其可观的应用潜力。例如，NgAgo 系统没有 PAM 序列依赖性，与 CRISPR 系统只能识别附近有 PAM 序列的靶点相比，NgAgo 理论上可切割的序列更多。其次，NgAgo 系统用以识别靶基因的先导物为 DNA(gDNA)，与 CRISPR 使用的 gRNA 相比，易用性更强，成本更低。另外，NgAgo 系统可以作用于很难被 CRISPR 切割的 GC 富集区域。

　　与此同时，NgAgo 系统也表现出一些劣势。NgAgo 系统使用 5’ 端磷酸化 gDNA ，这种先导物无法从质粒里表达获得，不能在靶细胞里产生，只能在细胞外合成后输入细胞内;研究者在执行基因编辑时，可能还需要持续向细胞内补充 gDNA。并且，gDNA 只能与新生的未成熟 NgAgo 蛋白结合形成复合物。

　　爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 专门研究基因编辑系统的优化，他表示，NgAgo 系统的目前的可重复性难题，无疑说明了这一系统的优化工作非常困难;他同时认为，NgAgo 系统难以优化的原因，可能就包括 s' 端磷酸化后的 gDNA 在哺乳细胞中不能稳定持续存在，以及 NgAgo 蛋白无法在成熟状态下与 gDNA 形成复合物。

　　已有9人声称 NgAgo 有效

　　自韩春雨2016年3月在线发表论文后，来自全世界的科研人员共发出将近400次获取 NgAgo 质粒的请求。Pooran Dewari 面向正在重复 NgAgo 的科研人员发起了一项调查。调查发现，截至2016年8月8日，193名被调者中，各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象(indels and knock-in)，100人声称无法观察到剪切，47人声称无法观察到基因插入。

　　然而，调查还显示，大部分被调者仍未对 NgAgo 丧失耐心，其中66%的被调者表示会等待他人对这一系统的优化结果，10%的被调者表示会自己优化 NgAgo，24%的人表示将继续使用 CRISPR。

　　附：NgAgo 可重复性问题事件节点

　　 2016年6月，网络上逐步有传言称，国内外有多家实验室重复不出韩春雨论文的实验结果，引起部分科学家的质疑。韩春雨在回复中表示，新系统刚出来都会“不好使”，他也认同目前 NgAgo 系统不够稳定，等2.0版本出来会找专门机构免费发放。

　　7月2日，方舟子公开质疑该实验的可重复性，NgAgo 研究可重复性问题自此规模化发酵，韩春雨也立刻进行了实验方法上的回应，称实验重复失败可能是由于支原体污染、试剂保存等问题。

　　7月28日，先前声称 NgAgo 有效的澳大利亚遗传学家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示，经进一步检测，该技术无法进行基因编辑。他表示，NgAgo 也许会奏效，但鉴于其不稳定性，它并没有 CRISPR 实用。

　　7月29日，西班牙遗传学家 Lluís Montoliu 向国际转基因技术协会 (ISTT) 的同僚群发邮件，建议“放弃所有NgAgo相关项目”。与此同时，之前声称 NgAgo 有效的印度分子生物学家 Debojyoti Chakraborty 及德国癌症研究中心的遗传学博士生 Jan Winter 也都表示先前结论有误;Jan Winter 同时表示，自己并不认可韩春雨此前做出的回应。

　　截至8月8日，爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 发起的一项针对 NgAgo 研究可重复性的线上调研已经收到近 200 位研究者的回复，其中各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象(indels and knock-in)，100人声称无法观察到剪切，47人声称无法观察到基因插入。